Przez całą pierwszą połowę XVI w. Uniwersytet błyszczy jako „nauk przemożnych perła”. W księgach miejskich Krakowa figurowało wtedy 20 tysięcy stałych, pełnoprawnych mieszkańców, zaś przez Uniwersytet przewinęło się ponad 12 tysięcy studentów. Jednak przystępujący do kontrataku Kościół katolicki uchwycił mocno uczelnię w swoje ręce i od niej rozpoczął proces krępowania życia intelektualnego i swobody myśli. Umowną granicą może być rok 1549, kiedy to w wyniku zatargu z władzami miasta, przy oburzającej bierności władz Uniwersytetu, doszło do gromadnego opuszczenia miasta i uczelni przez żaków – było to tzw. „wyjście żaków z Krakowa”. Uczelnia zlikwidowała wykłady greki i literatury włoskiego renesansu, co natychmiast odbiło się na jej popularności wśród synów szlacheckich i zagranicznych studentów, nie mówiąc już o poziomie. Z drugiej strony, studenci, zawsze podatni na napiętą atmosferę, wraz z dewotami i mętami brali udział w napadach na innowierców. Jaśniejszą kartą w tym rozdziale historii Uniwersytetu jest kategoryczne veto władz uczelni wobec prowadzącego populistyczną propagandę Kolegium Jezuickiego – w zamyśle konkurującego z Akademią i aspirującego do miana szkoły wyższej. Studenci UJ i uczniowie jezuitów przez kilka lat systematycznie okładali się kijami na ulicach Krakowa, aż wreszcie zniecierpliwiony król zamknął kolegium. W 1588 r. utworzono przy Uniwersytecie, jako szkolę przygotowawczą, najstarsze w Polsce gimnazjum, później wzbogacone fundacją Nowodworskiego (dziś „Nowodworek” jest najbardziej elitarną szkolą średnią w Krakowie). Ukończył je m.in. Jan III Sobieski.
Od końca XVI w. zaczyna się powolny, ale systematyczny upadek skostniałej Akademii. Reformy Hugona Kołłątaja z końca XVIII w. odrobinę poprawiły sytuację. Mimo znacznego obniżenia poziomu, przez cały czas na Uniwersytecie pojawiali się ludzie wybitni, tacy jak np. Karol Olszewski i Zygmunt Wróblewski, którzy w obecnym Collegium Phisicum jako pierwsi w świecie skroplili powietrze (1883 r.!). Generalnie jednak aż do początku XX w. Uniwersytet nie mógł się równać z największymi potęgami naukowymi Europy. W odrodzonej Rzeczypospolitej uczelnia szybko dźwigała się z upadku. Rozpoczęto budowę wielu nowych gmachów, m.in. Biblioteki Jagiellońskiej, do której średniowieczne inkunabuły i kodeksy przewieziono z XIV-wiecznych magazynów Collegium Maius w ostatnich dniach przed II wojną światową. 6 listopada 1939 r. na rozkaz feldmarszałka Keitla, szefa Wehrmachtu, aresztowano 183 profesorów UJ i AGH i wywieziono ich do obozów koncentracyjnych w Sachsenhausen. Część z nich na prywatne interwencje uwolniono jeszcze w czasie wojny, część powróciła po wojnie, a część nie powróciła nigdy. Była to niepowetowana strata dla nauki polskiej.
Obecnie UJ zajmuje drugie miejsce po Uniwersytecie Warszawskim pod względem liczby studentów. Jeśli chodzi o poziom, krakowianie mają na ten temat swoje zdanie. Faktem jest, że UJ, zarówno w kraju, jak i za granicą, swoim prestiżem przewyższa wszelkie inne ośrodki akademickie w Polsce.
